Heute wird die Kirche als Museum genutzt. Die Dauerausstellung informiert über die bau- und kirchengeschichtliche Rolle der Nikolaikirche in Berlin und erinnert an Persönlichkeiten, die dort gewirkt haben.
Themenbereiche, die das Museum in der Nikolaikirche behandelt, sind beispielsweise "Bestattungskultur im Kirchenraum – Das Pantheon der Berliner", "Verloren und wieder entdeckt – Der Münzschatz aus dem Turmknauf" und "Spurensuche – Die frühe Berliner Stadtgeschichte". Zu den Highlights des Museums zählen die Beyersche Gruft, der Münzschatz und Grabdenkmäler. In regelmäßigen Abständen finden in der Nikolaikirche auch Konzerte statt.